Sc Adv | 新发现！组蛋白3乙酰化选择性促进基底祖细胞增殖和新皮层扩张

撰文︱赵津悦

责编︱王思珍

哺乳动物大脑的新皮层呈放射状结构，分为六个神经元层和多个功能域，从而构成了人类感觉运动加工和智力能力的结构基础。在胚胎发育过程中，大部分皮层神经元由前脑发生区域（比如脑室区和脑室下区）的神经祖细胞（NPCs）连续分裂产生。不同类型的NPCs可以通过它们细胞的形态和极性、通过产生特定细胞系的能力、以及它们经历有丝分裂的位置来辨别[1-6]。

顶端祖细胞（APs）和基底祖细胞（BPs）是发育皮层中的两种主要的NPCs类型。APs包括顶端径向胶质细胞（aRGs），它们在脑室区（VZ）表面分裂。BPs则来源于APs，分为基底径向胶质细胞（bRGs）和基底中间祖细胞（bIPs），后者缺乏顶端接触，在脑室下区（SVZ）的内部和外部中有明确的有丝分裂活动[1-6]。aRGs和bRGs具有自我更新和不对称分裂的能力，可以直接或间接（通过BPs）产生新神经元[1-5, 7]。

最近的一些研究通过细胞分选和单细胞转录谱分析已经确定了一些对bIPs增殖、皮层扩张和折叠很重要的因素[8-14]。表观基因组方法最近也已建立，以揭示在单细胞水平上的表观遗传景观，但这些策略受到基因组覆盖率低的限制，并倾向于以一种易于分析基因组区域的方式聚集细胞。因此，bIPs的表观遗传分析仍然具有挑战性，表观遗传机制也被认为调节进化过程中新皮层扩张的基因表达（诱发）或抑制，然而具体机制尚未被探索。

近期，波鸿鲁尔大学人类遗传学系的Tran Tuoc和Andre Fischer团队在Science Advances上发表题为“H3 acetylation selectively promotes basal progenitor proliferation and neocortex expansion”的研究对这种表观遗传机制进行了探讨。研究揭示了组蛋白3（H3）乙酰化是bIPs扩增和皮层扩张的关键表观遗传调控因素。H3的第9位点赖氨酸（K）位点的乙酰化（H3K9ac）通过增加发育皮层中进化调控基因Trnp1的表达来驱动bIPs扩增。

为了测试进化中的皮层扩张是否与表观遗传的改变相关，研究者们首先研究了小鼠和人类皮质Tbr2阳性（⁺）的基底祖细胞（BPs）的组蛋白翻译后修饰是否不同（图1 A）。先从小鼠和人类正在发育的皮质中纯化Tbr2⁺ BPs（图1 B, C）。通过质谱量化他们发现，相比较于胎龄13.5天和16.5天的小鼠BPs，人类孕周14周和18周的BPs中多种表观遗传标记水平上调，其中H3K9ac、H3K18ac和H3K4ac水平上调最为明显（图1D）。这些结果表明表观遗传，特别是组蛋白3乙酰化，反映了从啮齿动物到人类的皮质进化过程中BPs的广泛变化。

图1 系统筛选显示小鼠和人类bIPs之间差异水平的表观遗传标记

（图源：Kerimoglu et al., Sci Adv 2021）

研究者选择变化最为明显的H3K9ac进行了深入分析。通过免疫荧光染色发现，在胎龄15.5天时的小鼠皮层和孕周20周时的人类皮层中, 在细胞皮质板（CP）的细胞和大多数Pax6⁺ APs中表达高水平的H3K9ac （H3K9ac^high），而在小鼠皮层中间区（IZ）的大多数细胞和VZ/SVZ区的许多细胞表达相当低水平的H3K9ac（H3K9ac^low）（图2 A, C, D），在人类皮层SVZ的内部（iSVZ）和外部（oSVZ）中，大多数PAX6⁺ BPs和TBR2⁺ BPs是H3K9ac^high细胞（图2 B-D）。通过荧光激活细胞分选术和免疫印迹（western blot）分析进一步证实了小鼠和人TBR2⁺ BPs中H3K9ac水平的差异（图1 E）。这些结果表明组蛋白3乙酰化水平在发育小鼠和人类皮质BPs中存在明显的差异。

图2 组蛋白H3K9在小鼠和人类发育皮层的BPs中具有不同的乙酰化

（图源：Kerimoglu et al., Sci Adv 2021）

那么，H3乙酰化水平上升是否会促进小鼠BPs的发生和增殖呢？作者首先通过给野生型（WT）小鼠胚胎注射了组蛋白脱乙酰基酶类（Hdac）抑制剂曲古菌素A（trichostatin A，TSA）以提高H3乙酰化水平（图3 A）。由于Pax6⁺ bRGs在WT小鼠皮层中相对少见[15, 16]，所以作者使用Baf155（BRG1-Associated Factor 155）条件性敲除（cKO）小鼠来研究Hdac抑制对BPs增殖的影响。在之前的工作中，作者发现小鼠皮层中Baf155缺失会促进APs的分层，从而增加Pax6⁺和Tbr2⁺ BPs数量，同时也减少Pax6⁺ APs数量[15, 16]。在此，作者发现，在WT和Baf155cKO鼠胚胎中，TSA治疗没有显著影响VZ区的Pax6⁺/Ap2γ⁺/Sox2⁺ APs的数量，但增加了SVZ/IZ区的Pax6⁺ / Ap2γ⁺/ Sox2⁺ /Tbr2⁺ BPs的数量（图3 B, C）。值得注意的是，TSA处理导致Baf155cKO鼠皮层中的Pax6⁺/pVim⁺ BPs数量增多最为明显（图3 D-G）。此外，一些aRGs和bRGs的标志蛋白，如Tnc、Ptprz1和Hopx，高表达于TSA处理的小鼠皮层的Pax6⁺/Tbr2⁻ a/bRGs细胞亚群（图3 H-J）。aRGs和bRGs具有不对称分裂和自我更新的能力。因此这些结果证明由HDAC抑制所诱导的H3乙酰化水平的升高会促进小鼠皮层BPs的发生和增殖。

图3 H3乙酰化的增强增加了BPs的数量

（图源：Kerimoglu et al., Sci Adv 2021）

为了确定H3乙酰化对皮质祖细胞（APs和BPs）的增殖是否重要，研究者使用Pax6、Tbr2和磷酸化组蛋白H3 （pHh3）的抗体进行免疫组化检测（图4 A, B）。结果表明TSA注射并不影响APs的增殖，APs内源性H3乙酰化已经具有高水平。值得注意的是，在HDAC抑制剂治疗后，对照组和Baf155cKO鼠皮质均出现更多的非顶端增殖细胞（pHh3⁺ BPs），同时增殖的Tbr2⁺/ pHh3⁺ BPs占Tbr2⁺细胞总数的比例更高，增殖的Pax6⁺/pHh3⁺ BPs占总Pax6⁺ BPs的比例更高（图4 A-C）。相比较于对照组（WT+Weh）经TSA处理的Baf155cKO鼠皮层SVZ/IZ区顶端表面到软脑膜（pia）的Tbr2⁺ BPs数量显著增加（图4 D, E）。这些结果证明组蛋白3乙酰化水平升高可增强发育中小鼠皮层BPs（非APs）的增殖。

图4 H3乙酰化特异促进发育中小鼠皮层中的BPs的增殖

（图源：Kerimoglu et al., Sci Adv 2021）

鉴于上述结果，即TSA处理对Baf155cKO鼠皮质中BPs发生有强的影响，因此，紧着，作者首先通过RNA测序和染色质免疫沉淀测序比较了TSA处理和Veh处理的Baf155cKO鼠皮质中的基因表达和全基因组H3K9ac谱（图5 A, B）。然而，在TSA处理的BPs中，H3K9ac的水平和BPs的典型基因表达水平均未发现发生改变，提示TSA处理的发育中的小鼠皮层中，大多数典型BPs基因的表达上调似乎是一个次要效应。然而在TSA处理的bIPs中，一些细胞周期基因（如Cdk19、Cdk5r1和Cdk14）和Insm1的表达水平上调（图5 C），这些基因都会促进bIPs的增值，但是这些基因启动子区域的H3K9ac水平没有增加（图5 D）。进一步的筛选确定了三个候选基因：Adrb1、Trnp1和Pcdh1（图5 E-H）。这些数据表明H3乙酰化通过直接激活一小组基因的表达促进了bIP的扩增。（补充：由基因Insm1编码的蛋白，即INSM1（Insulinoma-associated 1，胰岛素瘤相关蛋白1）是一种特异的DNA结合转录调节因子，在胚胎和（或）胎儿发育过程中的神经发生和神经内分泌细胞分化中起关键作用。）

图5 Tbr2⁺ bIPs中H3K9ac的靶基因

（图源：Kerimoglu et al., Sci Adv 2021）

有意思的是，在发育中的小鼠皮层，Trnp1只定位于VZ的APs核和CP的新生神经元，SVZ的Tbr2⁺ bIPs中几乎没有Trnp1表达（图6 A）[9]，这表现出与H3K9ac相似的表达模式（图1 E）。值得注意的是，Trnp1的表达（图6 A, B）和Trnp1启动子区的H3K9ac（图6 C）在人TBR2⁺ bIPs中的水平明显高于小鼠TBR2⁺ bIPs。这些数据表明H3K9ac水平直接控制Trnp1的表达。然后，利用CRISPR-dCas9基因编辑，使小鼠脑大脑皮层Trnp1启动子区域的H3K9ac水平显著增加，以探究高水平H3K9ac是否会增加Trnp1表达和bIPs增值。发现，处于细胞周期M期和S期的bIPs比例增加（图6 E, G）。类似地，上调Trnp1的表达水平，也会促进BPs的增值；敲低Trnp1可以挽救TSA处理（TSA使H3乙酰化水平提高）条件下的BPs增值（图6 E, H）。这些结果证明Trnp1启动子区H3K9ac水平的升高直接参与促进Tbr2⁺ bIPs增殖的过程。

图6 H3乙酰化通过激活Trnp1表达从而控bIPs的增值

（图源：Kerimoglu et al., Sci Adv 2021）

最后，为了探讨H3乙酰化在体内晚期皮质发生中的作用，研究者对小鼠胚胎进行了长时间的TSA处理。与Veh对照组相比，TSA 处理的小鼠的皮质表面积更大（图7 A, B）。经TSA处理后，神经元标志物（NeuN）的免疫染色显示皮质径向厚度明显增加（图7 C, D）。胚胎皮层中Satb2⁺和Ctip2⁺的投射神经元的数量也明显增加（图7 E, F）。并且，在TSA处理的野生型小鼠胚胎中出现皮质轻度折叠，而TSA处理的Baf155cKO小鼠胚在不同的皮质区域有更深的折叠（图7 G）。若提高H3K9ac水平，也有类似的现象（图7 H）。这些结果进一步证明在进化相关的基因Trnp1的启动子区H3乙酰化的增加会选择性地促进bIPs的增殖能力，导致哺乳动物进化过程中的神经元输出增强，皮层扩张增加，以及皮层折叠（图7 I）。

图 7 H3ac水平升高可促进皮质的扩张和折叠  

（图源：Kerimoglu et al., Sci Adv 2021）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，这项研究证明了人类神经祖细胞基底祖细胞（BPs）比小鼠BP具有更高的组蛋白3（H3）乙酰化水平，H3乙酰化水平升高优先促进基底中间祖细胞（bIPs）自我增值和增加神经元输出，继而导致小鼠新皮层的扩张和折叠。并且发现了H3乙酰化为一种调节新皮层的扩张新的的表观遗传机制。但是研究主要证明了H3乙酰化作为Trnp1功能上游的机制在进化过程中皮层发育中bIP增殖的作用，对于其他两个候选基因（Adrb1和Pcdh1）是各自独立，还是联合Trnp1在BPs扩增和皮层扩张中发挥作用，还值得进一步研究。总之，该研究打开了探索表观遗传在进化的新皮层扩张过程中作用机制的大门。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abc6792

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制版︱王思珍

本文完